熒光是發(fā)光的一種形式，是由吸收光或電磁輻射的物質(zhì)產(chǎn)生的光的發(fā)射。熒光分子響應(yīng)吸收的輻射，以重新發(fā)射波長更長、能量更低的光。由于其特性，熒光技術(shù)廣泛用于熒光成像和光譜學(xué)，利用熒光探針，染料和其他生物活性試劑。

• 細胞和細胞器染色

• 脫氧核糖核酸染色

• 熒光酶底物

• 離子指示劑和傳感器

• pH指示劑

熒光團是單獨使用或與分子結(jié)合以產(chǎn)生熒光探針的熒光化合物。熒光團一般分為四種類型：有機染料、熒光蛋白、量子點（發(fā)光納米晶體）和適用于無標記成像的生物結(jié)構(gòu)。大多數(shù)熒光團是低分子量（0.2-1 kDa）的小分子染料，有些是相對較大的蛋白質(zhì)，如GFP（綠色），YFP（黃色）和RFP（紅色）。熒光基團的廣泛選擇在生命科學(xué)和基礎(chǔ)研究中提供了廣泛的應(yīng)用，具體取決于其物理性質(zhì)，如尺寸、生物相容性、激發(fā)和發(fā)射波長、強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命以及與物質(zhì)的相互作用。

熒光探針是單個熒光團或與生物分子共價偶聯(lián)的熒光團。中銀科技網(wǎng)站上提供了幾種類型的熒光探針，如下所示：

細胞和細胞器染色： 熒光帶來了一種可視化細胞和細胞器結(jié)構(gòu)以及細胞追蹤的新方法。綠色熒光蛋白是一種238個氨基酸的蛋白質(zhì)，于1961年從水母維多利亞水母中分離出來，促進了熒光蛋白在細胞生物學(xué)中的應(yīng)用。不久之后，更多來自其他物種的熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)并分離出來。隨著熒光蛋白技術(shù)的快速發(fā)展，除了簡單追蹤活細胞中標記的生物分子之外，利用基因編碼的熒光團進行廣泛的應(yīng)用最近得到了充分認識。

其他非蛋白質(zhì)熒光探針可以對活細胞或固定細胞中的膜、細胞器、核酸和蛋白質(zhì)進行染色，以研究細胞和細胞成分。細胞染色技術(shù)用于顯微鏡，流式細胞術(shù)，并且在疾病診斷中的應(yīng)用一直在發(fā)展，從癌癥到細菌感染。據(jù)報道，Epicocconone是一種從黑真菌中代謝的長斯托克斯位移熒光染料，用于染色人結(jié)腸癌細胞系HCT-116，在590nm處顯示出最大發(fā)射峰。Epicocconone適用于活細胞成像，因為它不會影響哺乳動物細胞的生長，其濃度與用于染色的濃度相似。

脫氧核糖核酸染色： DNA染色劑是超靈敏的染料，使研究人員能夠可視化DNA片段和數(shù)量。菁染料、菲和吖啶、吲哚和咪唑類以及其他一些核酸染料通常包含在DNA染色劑中。在流式細胞術(shù)和顯微鏡中，Cy3和Cy5是常用的花青染料，通常帶有N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS-酯）反應(yīng)性基團，用于標記DNA。此外，TOTO系列、TO-PRO系列、SYTO系列和SYBR系列染料是針對不同用途優(yōu)化的花青染料。SYBR Green I優(yōu)先與雙鏈DNA結(jié)合，形成發(fā)射超過1000倍熒光的復(fù)合物。SYBR Green I已用于PCR、凝膠電泳、流式細胞術(shù)和顯微鏡中的DNA檢測。

赫斯特染料是雙苯甲酰亞胺，被 350 nm 的紫外光激發(fā)，在 460 nm 處發(fā)出熒光藍光。相對較大的斯托克斯位移使赫斯特染料適用于多色標記實驗。Hoechst染料通過選擇性地結(jié)合到富含AT的雙鏈DNA的微小凹槽來染色DNA。Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是該家族中的相關(guān)污漬。

熒光酶底物： 多種酶的熒光底物用于酶活性測定。它們通常由熒光化合物和特定的酶底物組成。在酶裂解時，熒光底物釋放熒光部分并產(chǎn)生熒光，其比率或強度可用于量化酶活性。一些底物是為活細胞酶測定開發(fā)的，能夠原位研究各種酶的生理功能。

離子指示劑和傳感器： 人體體內(nèi)鈣、鈉、鉀、鋅等金屬離子的濃度應(yīng)保持在適當范圍內(nèi)，以保證其正常的生物功能。離子指示劑通常有膜不透鹽形式和膜滲透性AM酯形式。進入細胞后，離子指示劑通過水解釋放，并與離子結(jié)合。鈣指示劑分為化學(xué)指示劑和遺傳編碼的鈣指示劑。化學(xué)指示劑是與鈣螯合劑偶聯(lián)的BAPTA結(jié)構(gòu)的熒光團，如吲哚-1、呋喃-2、氟-3、氟-4。鈣離子結(jié)合產(chǎn)生的熒光量子產(chǎn)率、激發(fā)/發(fā)射波長和光譜偏移用于定量。 基因編碼的鈣指示劑是來源于綠色熒光蛋白的熒光蛋白。

卟啉類似物被設(shè)計為金屬離子或陰離子化學(xué)傳感器，用于檢測環(huán)境系統(tǒng)和生物過程。傳感器的框架可分為2種類型：類型1由報告器和識別單元組成。一旦識別單元被合并以與目標分析物相互作用，就會從報告器報告光物理信號。第2類僅由一個組成部分組成，同時充當識別和報告單元。根據(jù)各種光物理過程開發(fā)不同類型的化學(xué)傳感器。

pH指示劑： 細胞內(nèi)pH值對細胞、組織和酶活性非常重要，異常的pH值通常與不適當?shù)募毎δ芎蜕L有關(guān)，這可以在癌癥等某些疾病中觀察到。細胞內(nèi)pH值的測量為研究細胞中的生理過程提供了關(guān)鍵信息。由于定性測量容易受到光程長度、溫度、激發(fā)強度變化和發(fā)射收集效率變化的影響，因此采用比例光譜法來檢測pH值。測量方法要求熒光探針對分析物具有差異敏感性，至少有兩個激發(fā)或發(fā)射波長。BCECF是活細胞中使用廣泛的比例激發(fā)pH指示劑。